TÉCNICAS Y ANÁLISIS DE ADN

El análisis de ADN comprende varias técnicas, las cuales han sido utilizadas para resolver casos como asesinatos, pruebas de paternidad y otros aspectos los cuales le han permitido dar un salto grande a la ciencia, especialmente a la genética.

“En 1986, se usó por primera vez el ADN para solucionar un crimen; la muerte de dos chicas en Leicestershire, Inglaterra. El proceso ha sido refinado desde entonces. Ahora los analistas pueden identificar el color del cabello de un sospechoso a partir del ADN y los expertos predicen que pronto será detectable también el color de la piel y las características faciales.

Muestras de ADN encontradas en la escena de un crimen son a menudo muy pequeñas para ser analizables. Los equipos de Reacción en Cadena de Polimerasa (PCR, según sus siglas en inglés) utilizan la manera natural en la que el ADN se copia a sí mismo y lo amplifican, proporcionándole a los criminalistas hebras replicadas de ADN que son utilizables. Este gran avance en la tecnología genética también ha ayudado a resolver casos que habían permanecido sin resolver por años. Ahora los llamados “casos fríos” están siendo abiertos de manera rutinaria e investigados con técnicas forenses modernas; algunos de estos datan de los años 50 y más allá.”
Tomado de http://www.tudiscovery.com/crimen/analisis/adn/index.shtml

TECNICAS DE ANÁLISIS DE ADN

1.ELECTROFORESIS
La electroforesis es un método de laboratorio en el que se utiliza una corriente eléctrica controlada con la finalidad de separar biomoleculas según su tamaño y carga eléctrica a través de una matriz gelatinosa.
Fue empleado por primera vez por en el año 1937, pero su importancia vino a incrementarse cuando en los años cincuenta E. L.Durrum y Arne W.K. Tiselius , impulsaron la electroforesis de zona, nombre que se asigno a la separación de materiales en un campo eléctrico en presencia de algún tipo de soporte; aunque este termino se limito originalmente al análisis de coloides y partículas submicroscopicas , se ha convertido en estos últimos años en una metodología aplicada a sustancias de bajo peso molecular.
La electroforesis en gel es un grupo de técnicas empleadas por los científicos para separar moléculas basándose en propiedades como el tamaño, la forma o el punto isoeléctrico. La electroforesis en gel se utiliza generalmente con propósitos analíticos, pero puede ser una técnica preparativa para purificar moléculas parcialmente antes de aplicar espectrometría de masas, PCR, clonación o secuenciación de ADN.

Cuando se ha completado la electroforesis, las moléculas más pequeñas han llegado al ánodo. Entonces se pueden 'revelar' mediante la adición de un colorante específico para hacerlas visibles. Se emplean compuestos como el bromuro de etidio, para los ácidos nucleicos, o tinción de plata, azul de coomassie o tinción fluorescente, para las proteínas. Asimismo se emplean otros métodos para visualizar la separación de la mezcla en el gel. Si el reactivo es fluorescente bajo la luz UV, se puede simplemente hacer una fotografía de la placa bajo dicha luz. También, si las moléculas contienen átomos radiactivos se puede efectuar una autorradiografía.
Si se han inyectado varias mezclas una junto a otra en la placa, se producirán separaciones paralelas. Cada separación mostrará distintas bandas correspondientes a cada componente de la mezcla. Si las separaciones son incompletas, se dará un solapamiento entre bandas haciendo indistinguibles dos o más componentes.
Las bandas en diferentes separaciones paralelas que están a la misma distancia del principio significa que contienen moléculas que han atravesado el gel a la misma velocidad. Existen marcadores especiales que contienen una mezcla de moléculas de tamaño conocido. Si se hace una electroforesis de un marcador con una mezcla desconocida, las bandas observadas en el marcador pueden ser comparadas con las obtenidas en la mezcla desconocida para determinar su tamaño o punto isoeléctrico. La distancia a la que se encuentra la banda del principio es (aproximadamente) inversamente proporcional al logaritmo del tamaño de la molécula.

2.HUELLA GENÉTICA
La huella genética o también llamada “fingerprinting” es una técnica utilizada para distinguir entre los individuos de una misma especie utilizando muestras de su ADN.

El ADN contiene toda la información necesaria para el desarrollo de los seres vivos. Los individuos de la misma especie comparten gran parte de su secuencia de ADN, pero existen determinadas regiones altamente variables que son propias de cada sujeto.
Estas zonas del genoma se denominan polimorfismos o marcadores genéticos, y son utilizadas para la identificación de personas ya que dos seres humanos no relacionados es poco probable que tengan en común los mismos marcadores genéticos. Al conjunto de polimorfismos específico de cada persona se le conoce como perfil genético.
El perfil genético individual hace posible diferenciar a cualquier persona, salvo en el caso de que posea un hermano gemelo monocigótico, ya que en este caso comparten la misma secuencia de ADN. El perfil genético caracteriza a cualquier individuo igual o mejor que sus huellas dactilares, por lo que también recibe el nombre de mapa o huella genética. La huella genética aporta la ventaja de que es mucho más precisa que otros métodos de identificación. Además, el ADN se halla en todas y cada una de las células del cuerpo humano, por lo que puede obtenerse de cualquier muestra biológica. La huella genética es única e invariable a lo largo de la vida.
La Huella genética se utiliza en Medicina forense, en la identificación de restos humanos, pruebas de paternidad o parentesco, compatibilidad en la donación de órganos... etc.
A continuación destacamos algunas de las situaciones en las que es útil realizar este estudio:

+Proporcionar un estándar (patrón o referencia) para la comparación e identificación de personas en profesiones de alto riesgo como por ejemplo, militares, bomberos o personal de las fuerzas de orden público.
+Disponer del perfil genético para identificación en caso de accidentes, incendios o desastres.
+Disponer de información para futuras pruebas de paternidad o parentesco.
+Niños adoptados o concebidos mediante técnicas de reproducción asistida empleando gametos donados. En estos casos los hijos no comparten el código genético con sus padres, de modo que en la identificación biológica no se pueden emplear los estudios de ADN por comparación con los progenitores. Disponer de la huella genética es mucho más útil en estos casos en las circunstancias anteriormente descritas (accidentes, secuestros, incendios o situaciones en las que pueda haber dudas de identificación).
Finalmente, como servicio extra a la obtención de la huella genética de un individuo, se puede almacenar el ADN propio para un uso futuro:

+En el caso de enfermedad genética diagnosticada
+Prevención de enfermedades genéticas familiares
+Solución de litigios de paternidades.
+Comparación e identificación de personas en profesiones de riesgo (militares, bomberos, policías)
+Comparación e identificación de personas en casos de sucesos

El DNA Fingerprint es una técnica utilizada para saber si una muestra de DNA pertenece a cierta persona. Al igual que una huella digital el DNA de cada persona es único, o mejor dicho, la secuencia de los pares de bases del DNA es única para cada persona. Científicos son capaces de identificar a una persona solamente por el ordenamiento de los pares de bases de su DNA. El DNA Fingerprint es usado en casos de paternidad y maternidad para identificar a los padres de un niño. Otra aplicación es en la medicina forense en casos de identificación de víctimas y establecer la inocencia o culpabilidad de los sospechosos. Y una tercera aplicación sería como identificación personal, pero por el momento el Fingerprint es muy complejo y costoso para usarse como identificación personal.
El DNA Fingerprint requiere la utilización de otras técnicas. El Southern blot es utilizado para el Fingerprint ya que con el uso de una sonda radioactiva es posible identificar fragmentos de una secuencia de DNA. Otra técnica usada es el PCR. Con esta técnica es posible amplificar el DNA de una pequeña muestra. El PCR es una técnica necesaria para casos criminales ya que el DNA encontrado en la escena del crimen generalmente no es suficiente para poder trabajar con él.

3.REACCIÓNN CADENA DE LA POLIMERASA
La reacción en cadena de la polimerasa, ya más conocida como PCR, es una técnica que permite replicar entre cientos de miles y millones de veces, en el transcurrir de pocas horas e in vitro, pequeñas cantidades de ADN. Uno de los aportes fundamentales de esta metodología a la investigación básica en biología molecular consiste, precisamente, en la rapidez y eficiencia mediante las cuales se realiza una tarea que antes requería largas y tediosas ¡ornadas. El producto que se obtiene al finalizar la reacción -una gran cantidad de un fragmento génico con alto grado de pureza- favorece la tarea de los investigadores empeñados en ampliar nuestros conocimientos sobre la estructura y función de los genes. Por su alta sensibilidad, esta técnica permite identificar un gen a partir de un solo cabello, una célula somática o un espermatozoide. Ha facilitado, y en muchos casos hecho posible, la tarea de identificación de personas, por ejemplo de hijos de desaparecidos, mediante el análisis de muestras del niño y de su abuela materna. Entre las aplicaciones médicas de la PCR cabe destacar su aporte al desarrollo de nuevas estrategias de diagnóstico. Permite detectar agentes infecciosos como los virus de las hepatitis B y C o regiones del genoma del virus de la inmunodeficiencia humana (HIV). Ha sido aplicada, por ejemplo, para diagnosticar la presencia o ausencia de HIV en recién nacidos de madres seropositivas, pues la existencia de anticuerpos maternos impide obtener resultados confiables, con los métodos convencionales, durante el primer año de vida. También ha facilitado el diagnóstico de enfermedades tales como las hemofilias A y B, la distrofia muscular y la fibrosis quística, e hizo posible reconocer mutaciones de genes vinculadas con enfermedades oncológ icas. Su sensibilidad permite detectar poblaciones residuales de células cancerosas en pacientes sometidos a quimioterapia y de este modo se ha podido determinar, con una antelación en extremo valiosa, un nuevo avance de la enfermedad. Existen ya modos de evaluar a través de la PCR el riesgo de padecer dolencias tales como diabetes de tipo I y la enfermedad celíaca. Precisamente los autores del presente trabajo y colaboradores han obtenido, mediante el empleo de esta técnica, resultados que indican la existencia de una vinculación entre determinadas variantes genéticasy dichas enfermedades en la población argentina.
Los genes son porciones de ácido desoxirribonucleico (ADN) que tienen la información necesaria para la fabricación de los ácidos ribonucleicos (ARN) y, en última instancia, a través de éstos, de las proteínas: el ARN "copia" el mensaje contenido en el ADN y a partir de él da lugar a la correcta formación de la cadena o secuencia de aminoácidos que constituyen las proteínas.
Todos los genes están compuestos por la misma materia prima: una sucesión de nucleótidos. Cada nucleótido está formado por un grupo fosfato, un azúcar con cinco carbonos (la desoxirribosa) y una de las siguientes bases nitrogenadas: adenina, timina, guanina o citosina. Los genes no se distinguen unos de otros por tener una composición fisicoquímica muy diferente, sino por el orden o secuencia en la que estas cuatro bases se disponen a lo largo de la molécula de ADN (véase "Somera descripción del ADN"). El hecho de que los genes no se distingan por su composición fisicoquímica hace prácticamente imposible aislarlos mediante el empleo de métodos bioquímicos de fraccionamiento del tipo de los usados para purificar proteínas como son, por ejemplo, la cromatografía, la electroforesis o la ultracentrifugación.
Por otra parte, cada gen es una unidad de información sin solución de continuidad respecto del resto del ADN en el que está inmerso. Esto significa que a todo gen lo preceden y suceden otras secuencias de ADN que, en general, no tienen relación con él. El gen que codifica para la insulina, por ejemplo, tiene una "longitud" de 1.700 bases y su masa representa sólo la dos millonésima parte del ADN contenido en el núcleo de una célula humana...
Hasta mediados de la década del ochenta, la única estrategia posible para aislar un gen y obtener grandes cantidades del mismo en estado puro era el "clonado molecular". Este método se basa en la introducción de fragmentos de ADN, uno de los cuales contendrá el gen de interés, en vectores. Éstos son moléculas de ADN (plásmidos o ADN de bacteriófagos) capaces tanto de transportar fragmentos ajenos a su estructura original como de multiplicarlos dentro de bacterias. Si se conoce un pequeño tramo de la secuencia de aminoácidos de una proteína cuyo gen se desea "clonar" (multiplicar), se pueden diseñar métodos para identificar qué bacterias llevan el vector que transporta dicho gen. Este reconocimiento también se puede realizar si se dispone de un anticuerpo contra la proteína resultante del gen que se desea clonar. En este caso se reconoce la bacteria portadora porque fabrica la proteína codificada por el fragmento de interés, la cual se une específicamente al anticuerpo.
Una vez aislado el gen no sólo resulta posible determinar con exactitud su secuencia de bases o analizar en detalle la información de la que es portador, sino que también se puede estudiar su expresión (la manera en que dirige la síntesis de la proteína correspondiente) en distintos organismos y tipos celulares, introducido en células en cultivo o en animales de experimentación, etcétera. Estas técnicas, ya clásicas, han permitido el aislamiento y caracterización de decenas de miles de genes de microrganismos, animales y plantas, lo que provocó un cambio cualitativo en la comprensión del funcionamiento de la célula.
En 1986, K. Mullis, un investigador de la Corporación Cetus, inventó un método para lograr la multiplicación in vitro de fragmentos definidos de ADN sin necesidad de recurrir a los vectores y su replicación en bacterias. Este método revolucionaría en corto tiempo el conjunto de técnicas de la biología molecular. Su uso se extendió rápidamente a miles de laboratorios, no sólo de investigación básica, sino también de diagnóstico clínico. Se trata de la reacción en cadena de la polimerasa, ya muy conocida como PCR, siglas provenientes del inglés Polymerase Chain Reaction.

LA TECNICA PCR
Esta técnica permite multiplicar ("amplificar" es, en realidad, el término que se ha impuesto) pequeñas cantidades de ADN entre cientos de miles y millones de veces. El tramo destinado a reproducirse puede tener desde cincuenta hasta más de dos mil nucleótidos de longitud. El segmento de ADN que sirve de molde no requiere estar necesariamente en estado puro, sino que puede ser parte de mezclas complejas. Puede ser, por ejemplo, ADN nuclear total.

El método se basa, en su forma más simple en la realización de tres reacciones sucesivas llevadas a cabo a distintas temperaturas. Estas reacciones se repiten cíclicamente entre veinte y cuarenta veces (véase la figura 1). La muestra se calienta, en el primer paso, hasta lograr la separación de las dos cadenas que constituyen el ADN, hecho que se conoce como "desnaturalización". En el segundo paso, la temperatura se reduce para permitir el "apareamiento" de cada una de dos cadenas cortas de nucleótidos (oligonucleóridos) con cada una de las hebras separadas del ADN molde. Se trata de segmentos de ADN de cadena simple, sintetizados en el laboratorio y diseñados de manera tal que permiten definir los límites del tramo de ADN que se desea replicar. Obviamente, para que se pueda producir el apareamiento, cada uno de estos oligonucleótidos, a los que se denomina "iniciadores" o primers, debe ser complementario del tramo al que tienen que unirse en las cadenas separadas del ADN molde. En tercer lugar, una enzima ADN polimerasa extiende los primers, en el espacio comprendido entre ambos, sintetizando las secuencias complementarias de las hebras del ADN molde. Para ello, la ADN polimerasa usa desoxidonucleósidos trifosfato (dNTPs) agregados a la mezcla de reacción. La temperatura a la que se realiza el tercer paso está condicionada por aquélla a la cual "trabaja" la enzima ADN polimerasa. Al cabo del primer ciclo de tres reacciones (desnaturalización, apareamiento, extensión) el tramo de ADN elegido se ha duplicado y el doble de su cantidad original se encuentra disponible para ser nuevamente replicado en un segundo ciclo. El resultado de la aplicación de numerosos ciclos "en cadena" da lugar a la amplificación geométrica del segmento de ADN delimitado por los primers.
Para replicar el ADN, la técnica PCR hizo uso, en un principio, de la ADN polimerasa de la bacteria Escherichia coli. Pero esta enzima resulta desactivada debido a la alta temperatura requerida para desnaturalizarla doble cadena del ADN, por lo cual debía agregarse enzima fresca al comenzar el tercer paso de cada ciclo. Este inconveniente fue solucionado de manera ingeniosa cuando se la reemplazó por su equivalente de la bacteria "termófila" Thermus aquaticus. En efecto, la ADN polimerasa de este microrganismo, denominada Taq polimerasa, actúa eficientemente entre los 75° C y los 80° C y resiste más de dos horas a 93° C. De esta manera es posible mezclar todos los componentes de la PCR al comenzar el primer ciclo y la reacción en cadena puede llevarse a cabo mediante equipos automatizados que realizarán los ciclos térmicos programados. Estos equipos son provistos por numerosas empresas extranjeras, pero ya ha sido fabricado uno por la industria argentina. Todo esto no hace más que confirmar la creciente popularidad de la PCR entre investigadores, médicos y bioquímicos clínicos.
Una vez finalizada la reacción se habrá logrado fabricar, en pocas horas, gran cantidad de un fragmento génico con un alto grado de pureza. Obtener el mismo resultado utilizando las técnicas clásicas de clonado llevaría varios días de tedioso trabajo. Por otra parte, la técnica PCR es el método de detección de secuencias de ADN más sensible conocido hasta la fecha: mediante ella resulta posible identificar un gen a partir de un solo cabello, una célula somática o un espermatozoide. Es, por lo tanto, un instrumento extremadamente valioso para establecer, por ejemplo, lazos de parentesco.

Acá encontramos un esquema del PCR

4.PERFILES DE ADN
(También conocido como DNA profiling)
En los últimos años, las cortes alrededor del mundo están utilizando más y más los análisis de ADN en sus procedimientos criminales y verificación de familiares en casos de reclamo de herencias. El perfil genetico también tiene varios usos en industrias de alto riesgo.
Estos análisis son generalmente usados por investigadores privados e individuos cotidianos para comparar muestras biológicas y determinar infidelidades.
El proceso que engloba la lectura de datos mostrando el ADN de un individuo es conocido como “Perfil de ADN” o “DNA Profiling”. Normalmente, son los científicos forenses, quienes están entrenados para poder leer estos datos y extraer los resultados de este, es un proceso usado para obtener datos genéticos, en procedimientos legales y de investigación científica en el genoma humano.

Para proceder con el proceso del perfil genético, un científico forense necesita una muestra de ADN de un individuo. Esto puede ser obtenido de formas muy variadas, la más común a través de una prueba de sangre, tomar una muestra del cabello o a través de una muestra de saliva de la mejilla, de todo esto un perfil único de ADN será compilado. Este proceso es relativamente joven en el mundo de la ciencia y fue descubierto en 1984 por el Dr Alec Jeffreys. Desde entonces, se ha convertido en el sistema de identificación genético más usado y popular en el mundo.
Este proceso no es absolutamente certero, sin embargo, en una primera observación la mayoría de las secuencias de ADN humanas parecen idénticas. Esta es la razón por la que la mayoría de los científicos deben extraer el VNTR (variable number tándem repeats) que se encuentra sobre un cromosoma, ya es estos se agrupan de forma única a un individuo. Los VNTR son mostrados usando un número de técnicas, incluyendo el blotting o southern como es conocido más técnicamente, amplificando variaciones conocidas para producir puntos de color sobre tarjetas y la multiplexación (usando tinte fluorescente para identificar el VNTR).
La técnica del blotting no se usa muy a menudo hoy día, ya que puede llevar meses obtener los resultados, aunque la técnica de análisis de PCR (Polymerase Chain Reaction) es la que fue usada antes de casi cualquier técnica de identificación de perfil de ADN. El sistema comprende añadir un encima que se une al ADN y lo replica, seguidamente se calienta la mezcla a unos 200ºC antes de enfriarlo y repetir este proceso 30 veces hasta que se haya formado una cantidad de ADN suficiente, para poder ser analizado adecuadamente.

Las huellas genéticas o el perfil de ADN son extraordinariamente fiables, aunque no son un 100%. Existen raros casos de individuos que tienen que separar conjuntos completos de ADN (estos son conocidos como “Quimeras”) y sus ADN pueden dar resultados confusos, aparentemente incorrectos.
El perfil de ADN es un proceso controvertido ya que ciertos Bancos de ADN mantienen registrados los perfiles genéticos de personas desconocidas. Algunas personas opinan que esto es una violación de los derecho humanos y un paso hacia una sociedad totalitarista, aunque por otro lado otros opinan que el perfil de ADN es un proceso absolutamente necesario e indiscutible, que puede cambiar las vidas de muchas personas que desconocen de sus familiares o su composición genética.